利用种子吸收法在番茄中表达 GFP

植物瞬时表达系统的侵染方法有叶片注射法、真空侵染法和摩擦接种法等。这些侵染方法的操作都较为繁琐，不适合大量植物的侵染工作，而且都具有各自的局限性。本文介绍的新型侵染技术—种子吸收法，是通过种子自然吸收菌液的能力进行外源蛋白的表达。我们采用这种侵染方法在番茄(S. lycopersicum)中成功表达了GFP蛋白，其表达量约占植株总可溶性蛋白的4.85%。与之前的侵染方法相比，这种侵染技术不仅有利于植物大规模的侵染工作，提高生产效率，有利于植物瞬时表达系统的进一步推广和应用，而且能够侵染叶片面积小、叶形狭长或者难以注射的植物，如番茄、大豆等，进一步扩大了植物生物反应器的宿主范围。

农杆菌介导的瞬时表达体系的建立

制备农杆菌感受态细胞 EHA105，采用冻融法将 1 μL 质粒 30B-GFP 转入农杆菌 EHA105中。将培养物在 12 000 r/min 下离心 1 min，将所收集到的菌体用 50 μL LB 培养基重悬，涂在含有卡那霉素 50 μL/mL，和利福平 25 μg/mL 的 LB 培养基平板上。在 28℃条件下，培养2-3 d，可在培养基上选出阳性克隆。

利用种子吸收法侵染番茄与 GFP 表达的表型观察

利用冻融法将质粒 30B-GFP 转化农杆菌感受态 EHA105 中，对转化平板上的单菌落进行菌落 PCR，将阳性菌落进行过夜培养，提取质粒后作酶切鉴定。将成功转化农杆菌感受态 EHA105 的阳性克隆保存菌种，用于菌液重悬液的制备。用菌液重悬液 OD600 =1.0 侵染番茄(S. lycopersicum)发芽种子 24 h 后，继续用水培法培养一周；将小苗移栽花盆中，侵染后 7 d 在新生叶中观察到绿色荧光，GFP 的表达表型在的LUYOR-3410长波高强度紫外线灯照射下观察。侵染后 7~14 d，叶片中的荧光现象逐渐加强，在侵染后 14 d，多数茎和叶片中有较强的绿色荧光积累；而侵染 空载体的对照植物中未观察到绿色荧光现象。

种子吸收法侵染条件的优化

首先对影响 GFP 表达的关键因素—菌液浓度进行了优化。制备菌液重悬液 MMA (10mmol/L MgCl2，10 mmol/L Mes，100 μmol/L AS)。分别选择 MMA OD600为 0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6 的浓度利用种子吸收法对番茄(S. lycopersicum)发芽种子进行侵染，每种菌液浓度侵染 50 粒发芽种子在侵染前 MMA 将静置 3 h。侵染两周后观察并记录不同菌液浓度条件下 GFP 的表达植株数，并计算番茄中 GFP 的表达效率（统计表达 GFP 的植株数占总侵染数的百分比）,重复试验两次。在重悬液 MMA OD600为 1.0 时, GFP 的表达效率更高，3 次实验的平均值为 86%（图 2A），因此，利用种子吸收法在番茄(S. lycopersicum)植株中表达外源蛋白的最适菌液浓度为 OD600=1.0。

 温度是影响植物生长的关键因素之一，也是影响种子发芽生长的关键条件，因此我们在最适菌液浓度条件下，对不同的温度条件进行种子发芽培养和农杆菌菌液吸收实验的检测，重复试验两次，结果表明在 OD600=1.0 条件下，T = 28℃为种子吸收菌液的最适温度，温度过高时（T﹥30℃）,不利于发芽种子对菌液的吸收，从而影响了外源基因在植物中的表达。

利用农杆菌侵染植物叶片后要进行暗培养 24 h 左右，同样在菌液侵染后进行了暗培养优化实验，将暗培养时间分别设为 12 h、24 h、36 h 和 48 h 来检测最适合种子吸收法的暗培养时间，重复试验两次。结果发现随着暗培养时间的适当延长，能够有效提高种子吸收法的表达效率。

利用种子吸收法在番茄中表达 GFP

首先在转录水平上对基因 GFP 的表达进行了检测。根据紫外条件下的观察结果，GFP蛋白主要在茎和叶片中积累。分别从侵染后 14 d（dpi）的番茄(S. lycopersicum)叶片和茎中提取总 RNA 为模板，进行 RT-PCR 反应，使用 Actin 作为内参。半定量 PCR 的结果表明叶片中比茎中的 GFP 表达水平高（图 3A）。由于植物叶片为生产外源蛋白的主要器官，以侵染后 14 d 的叶片为植物材料采用 PBS 法提取总可溶性蛋白，对 GFP 蛋白的表达水平进行定量分析，即运用 Bradford 建立的考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合的方法，在紫外分光光度计下测定其浓度，作标准曲线分析，结果显示 GFP 蛋白的表达量约占植株叶片总可溶性蛋白的 4.85%。我们又分别提取茎和叶片中的总可溶性蛋白，对茎和叶片中 GFP 的表达量进行 Western blotting 检测，结果表明 GFP 在茎和叶片中大量表达。

新型侵染技术的建立和优化

在研究中，我们以 GFP 作为报告基因，对多批侵染的番茄(S. lycopersicum)发芽种子进行连续 28 d 的 GFP 表达表型的紫外观察，掌握了应用种子吸收法在番茄中瞬时表达外源

蛋白的过程及特征。确定该方法的最适菌液重悬液的浓度 OD600值为 1.0。以最适菌液重悬液浓度进行侵染，侵染后 7 d 在番茄(S. lycopersicum)新生叶片中开始出现绿色荧光现象，侵染后 14 d 叶片中的绿色荧光现象显著增强，在侵染后的 28 d 内绿色荧光持续存在并在 28 d后逐渐消退。而叶片注射法通常在侵染后 1 周左右可以达到蛋白的更大表达量。因此，与叶片注射法相比，种子吸收法表达外源蛋白的周期较长，这可能与侵染材料（发芽种子）需要一定的生长过程有关。而且，根据我们长期研究和观察结果发现 GFP 蛋白在植物中的表达周期受具体的实验条件、菌液活性、植物的培养条件等多种因素的影响。

以上研究表明我们建立并优化了一种新型的农杆菌侵染植物并瞬时表达外源基因的技术—种子吸收法，利用该技术在番茄(S. lycopersicum)中成功的表达了报告基因 GFP，其蛋白表达量约占叶片总可溶性蛋白的 4.85%。与 Yang 等[24]研究的根部吸收法（GFP 蛋白的表达量约占总可溶性蛋白的 6%）相比，种子吸收法的表达水平略低。而利用稳定转化系统表达外源蛋白的水平普遍较低，一般可占总可溶性蛋白的 0.01%~1%，因此与稳定转化系统相比，种子吸收法具有较强的优势，完全适合外源蛋白的高水平表达。叶片注射法是瞬时表达系统较为成熟的一种侵染方法，进行外源蛋白表达的效率一般在 90%左右，而种子吸收法的表达效率为 80%左右。这可能由于番茄种子较小，吸收能力较弱，在侵染过程中较难控制番茄发芽种子的吸收效率而影响了其表达效率。因此，在研究中对番茄种子吸收法进行了多方面的研究来进一步提高其侵染效率和表达效率，从而更有效地表达外源基因，其中利用真空侵染技术能够提高 GFP 的表达效率 10%以上。根据 Fan 等研究，我们同样利用豆科表达载体在大豆(G. max)和豌豆(P. sativum)等植物中进行了相关的侵染实验研究。初步研究结果表明种子吸收法能够侵染不适合用叶片注射法进行侵染的植物，如豆科、十字花科等，进一步扩大了侵染的宿主范围。

 种子吸收法更适合规模化生产

我们所熟知的一些植物瞬时表达系统的侵染技术，如叶片注射法，真空侵染法，还有摩擦接种技术等，都具有各自的局限性，叶片注射法人工操作较为繁琐，需要逐个叶片进行注射；摩擦接种法操作要求严格，体外转录 RNA 容易降解，而且需要逐个叶片进行涂抹接种；真空侵染法对离体叶片和整株进行侵染，植株数量受到明显的限制。不难想象这些技术方法的不便之处都严重阻碍了植物瞬时表达系统在规模化生产上的应用和推广。因此，建立和优化更多更有效的侵染技术对于植物瞬时表达系统的发展是至关重要的。我们使用的表达载体 30B通过农杆菌的Ti质粒上的T-DNA将植物病毒基因组带入植物细胞，转录成 RNA 病毒后再进行植物病毒的高水平复制和系统性侵染，避免了对 RNA 病毒直接操作，这就为实验研究提供了重要的基础条件。我们的研究结果表明种子吸收法是一种简单而有效的农杆菌侵染方法，具备操作简便的优势，更适合规模化生产外源蛋白，具有重要的应用价值。同时，这种方法能够进一步扩大宿主范围，为实现更多植物的有效侵染提供了有力的理论依据。