Northern blot外源基因表达转录水平检测操作步骤

外源基因的表达需要经过转录（mRNA生成）、翻译（蛋白质合成）、修饰等过程，最后才能形成具有生物学活性的蛋白质分子，因此，对一个基因表达的检测，可以从其表达过程的不同阶段来进行。

转录水平指的是mRNA的表达水平，然后mRNA经过翻译成为目的蛋白。mRNA的检测是研究基因表达盒功能的重要，常用方法，通过mRNA的分析，可以大致估计一种基因的翻译水平，但mRNA不能代替蛋白质水平的分析，因为还有翻译效率和RNA降解速度，以及蛋白质剪切和分解速度等因素的影响。目前检测mRNA的方法包括Northern印迹（Northern blot）、逆转录-聚合链式反应（RT-PCR）、实时定量PCR（real time PCR）以及核糖核酸酶保护分析（RPA）等。

Northern印迹技术
一、原理
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和用探针进行杂交检测，检测样品中是否含有基因的转录产物及含量。

二、操作步骤
1、制胶
称取0.42g琼脂糖加入三角瓶中，加入DEPC水30.4ml，微波加热溶解。在通风橱中加入3.6ml的10xMOPS电泳缓冲液和1.05ml甲醛，轻轻震荡混匀，放入60度水浴中。将溶胶倒入制胶板中，插上梳子。凝固后转移如电泳槽，加1xMOPS电泳缓冲液。
2、RNA样品制备
在RNA样品中（0.5-10微克）加入10xMOPS电泳缓冲液、8.75微升甲醛、25微升甲酰胺，混匀后65度保持15min。短暂低速离心后立即放冰上5min。每份RNA样品加入10微升加样缓冲液。

3、电泳
将RNA样品加入上样孔电泳，当胶中的溴酚蓝接近胶边缘时终止电泳，在LUYOR-3410高强度紫外线灯下，用尺子测量18SRNA、28SRNA、溴酚蓝到点样孔的距离
4转膜
用3%的双氧水侵泡真空转移仪，用DEPC水冲洗。用RNAZap擦洗电极板和转移框，用DEPC水冲洗2次。连接真空泵和真空转移仪，剪取1块合适大小的转印膜，转印膜在20xssc润湿5min，放在电极板适当的位置。将胶的多余部分切除，切后胶的大小与转印膜一致。将较放在膜上，排出气泡。封闭转移框，打开真空泵压力维持在50-58mbar，立即将20xSSC加到胶面和四周，每隔10min在胶面上加1ml20xSSC，真空转移2h。转膜后，用镊子夹住膜，在1xMOPS中泡洗10s，去除残余的胶和盐。用吸水纸洗去膜上多余的液体后，将膜置于紫外交联仪中自动交联。将胶和紫外交联后的膜，于LUYOR-3410高强度紫外线灯下检测转移效率。将膜在-20度保存。

5探针的准备
（1）、在1.5ml离心管中配置以下反应液：模板DNA（25ng）1微升，随机引物2微升，灭菌水11微升，总体积14微升。
（2）95度加热3min后，迅速放置于冰上冷却5min
（3）在离心管中按照下列顺序加入溶液：10x缓冲液2.5ul，DNTP混合物2.5ul，32P-dCTP 5ul，Exo-free Klenow Fragment 1ul
（4）混匀后，37度反应30min，短暂离心，收集溶液。
（5）65度加热5min使酶失活。

6、探针的纯化及比活性测定
（1）将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，侵泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE缓冲液（PH7.6）
（2）在1ml注射器层析柱中填装Sephadex G50凝胶。
（3）将注射器放入一只15ml离心管中，注射器把手架在离心管口，1600g离心4min，凝胶压紧后，补加Sephadex G50凝胶，重复此步骤直到凝胶高度达到0.9ml。
（4）用100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。
（5）倒掉离心管中的溶液，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了凝胶的注射器插入离心管，注射器口对准1.5ml离心管。
（6）将标记的DNA样品加入25ul STE
（7）1600G离心4min，DNA将流出并被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在色谱柱中。
（8）测比活性（要求106cpm/ml）

7、预杂交
（1）将Northern预杂交缓冲液在杂交炉中68度预热，并涡旋使未溶解的物质溶解。
（2）加入适当 的预杂交缓冲液到杂交袋中，42度预杂交4h

8、探针变性

（1）用10mmol/L EDTA将探针稀释10倍。
（2）90度热处理稀释的探针10min后，立即放置冰上5min
（3）短暂离心，将溶液收集在管底。

9、杂交
（1）加入0.5ml杂交缓冲液到变性的探针中，混匀。
（2）从杂交袋中移出预杂交缓冲液后，将含探针的杂交缓冲液加入
（3）42度杂交过夜（14-24h）

10、洗膜
（1）1xSSC加入0.1%SDS，（100cm2膜面积加入20ml），室温下晃动洗膜15min，2次。
（2）0.25xSCC加入0.1%SDS，（100cm2膜面积加入20ml），室温下晃动洗膜15min，2次。

11曝光
（1）将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防干燥
（2）检查膜上放射性强度，估计曝光时间
（3）将X射线底片覆盖于膜上，曝光
（4）冲洗X射线底片，扫描结果。